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癌癥的發(fā)病機制較為復雜，目前學界廣泛接受的觀點是相關基因發(fā)生突變是致癌性轉變的根本原因。即在各種因素的影響下：

原癌基因產生突變，導致細胞無限制生長；
抑癌基因失活，導致細胞增殖與休眠紊亂，不能正常凋亡。

最終質變?yōu)榧毎敖M織水平的變異，導致癌癥的發(fā)生。

所以癌癥的發(fā)生和發(fā)展實際上是一個較為漫長的過程，在臨床中，完全可以通過基因檢測，達到早發(fā)現、早診斷、早治療的目的。

目前，癌癥相關基因檢測主要基于實時熒光定量PCR（qPCR）和高通量測序（NGS）兩項技術，其中qPCR具有多項技術優(yōu)勢：準確率高、特異性強、靈敏度高、操作簡單、成本較低，被廣泛應用于實驗室及臨床診斷中。

今天，我們就來好好聊一聊qPCR

探針法qPCR 技術原理：

qPCR依據檢測原理不同，分為染料法和探針法。探針法qPCR需針對目的基因設計特異性引物與特異性熒光探針，探針的5’端標記一個熒光報告基團（Reporter，如FAM、VIC、HEX等），3’端標記一個熒光淬滅基團（Quencher，如TAMRA、BHQ1等）。

當熒光探針保持結構完整時，探針與模板退火結合，其特異性結合位點位于正反兩條引物之間。5’端報告基團受儀器光源激發(fā)的熒光正好被近距離的3’端淬滅基團淬滅，儀器檢測不到5′端報告基團所激發(fā)的熒光信號。
隨著擴增進行，DNA聚合酶在延伸過程中遇到與模板結合的探針，因其雙鏈特異性的5’-3’外切酶活性，就會切割熒光探針，釋放5’端報告基團游離于反應體系中，遠離3’端淬滅基團，此時5’端報告基團受激發(fā)所產生的熒光信號就可以被儀器檢測到。每擴增一條DNA鏈，就有一個游離的熒光分子形成，熒光信號的強弱與擴增產物量成正比，最終通過數據分析實現對初始模板的定量。

圖1. 探針法qPCR技術原理示意圖

作為一種有效的癌癥篩查檢測及伴隨診斷技術，探針法qPCR涉及領域涵蓋癌癥的預防與治療。這項技術不但能有效地檢測到基因的突變，還可以準確檢測相關基因的表達量。

qPCR應用于癌癥篩查

探針法qPCR目前已廣泛應用于多種癌癥相關基因的表達檢測，包括：

端粒酶hTERT基因
慢性粒細胞性白血病WT1基因
腫瘤ER基因
前列腺癌PSM基因
宮頸癌相關病毒HPV
……

其中女性高發(fā)惡性腫瘤之一的宮頸癌，早期發(fā)現并及時治療，可以達到非常好的療效，治愈率在90%左右。目前已證實高危人乳頭瘤（HPV）病毒持續(xù)感染與宮頸癌有著密切聯系，因此，對于高危HPV病毒的專項檢測，已成為宮頸癌篩查的重要手段。高危HPV病毒核酸檢測與細胞學聯合篩查被越來越多的應用于臨床。

圖2. 高危HPV病毒核酸檢測與細胞學聯合篩查可有效降低漏診率

qPCR應用于抗癌藥物研發(fā)

除此之外，探針法qPCR還可應用于抗癌藥物的研發(fā)。在新藥的開發(fā)過程中，快速了解藥物對癌癥進程的影響可以為新藥開發(fā)節(jié)約大量的人力、時間和資金。

與Elisa等方法相比，探針法qPCR技術可以快速、準確、靈敏地測定血液或組織中目的基因的表達量，為比較不同配方的療效、用藥量、用藥時間等，提供快速、準確的評價。

圖3. qPCR檢測流程示意圖

手把手實驗教學

p53是重要的抑癌基因，幾乎參與所有癌癥的發(fā)生與發(fā)展，其編碼蛋白有促使損傷DNA修復、損傷細胞凋亡從而防止癌變的功能。

假設現在有兩種配方藥物，分別加入細胞培養(yǎng)液中，看不同配方藥物對p53 mRNA水平的影響，應該怎樣來設計實驗以及分析結果呢？

實驗設計:

分別種三皿細胞，一皿加入配方一藥物，另外一皿加入配方二藥物，剩下一皿加入對照。處理一段時間之后，分別收集細胞并提取RNA，再進行反轉錄，以反轉錄得到的cDNA為模板進行qPCR。qPCR如下圖所示進行加樣：

圖4. qPCR加樣示意圖

注意區(qū)分 “技術重復”和“生物學重復”這兩個概念，圖4中p53和β-actin每個實驗組和對照組都各有三個qPCR復孔，這是技術重復，目的是消除本次實驗的操作誤差。生物學重復指的是做三次獨立的重復試驗，目的是消除組內誤差、提高結果的可靠性。在本例中，就要求在其他時間另外再種三皿細胞，再分別處理后提取RNA，接著再做反轉錄和qPCR，如此做了三次獨立重復實驗之后才能算作三次生物學重復，統(tǒng)計誤差的來源應該包括生物學重復和技術重復。

做完上述實驗之后，假設得到結果如下：